申请号:201310421519.2

公开（公告）号:103509817B

分类号: C12N 15/81(2006.01);C12N  1/19(2006.01);C12N  1/16(2006.01);C12P  7/64(2006.01);C12R  1/645(2006.01)

主分类号:C12N 15/81(2006.01)

名称:一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法和应用

公开（公告）日:2015.09.09

申请日:2013.09.16

　　摘要:本发明涉及一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法和应用，其基因工程菌的构建方法主要将油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2基因和二酰甘油酰基转移酶vfDGAT2构建融合表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因和vfDGAT2基因在粘红酵母体内获得高效表达。与未转基因粘红酵母相比，本发明的转基因粘红酵母转化子油脂含量提高2.76倍，亚油酸含量提高25.86%。

主权项:1.一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，将油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2基因和二酰甘油酰基转移酶vfDGAT2构建融合表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因和vfDGAT2基因在粘红酵母体内获得高效表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下：(1)粘红酵母进行活化和培养：将粘红酵母保藏斜面转接到PDA培养基上，28℃培养48h之后，挑2环接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，28℃振荡培养24h，然后按1:10的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28℃振荡发酵72h，发酵结束经离心收集菌体；种子培养基：15g·L-1葡萄糖，1g·L-1酵母粉，2g·L-1(NH4)2SO4，7g·L-1KH2PO4，2g·L-1Na2HPO4，1.5g·L-1MgSO4，PH5.5；发酵培养基：50g·L-1葡萄糖，1g·L-1酵母粉，2.5g·L-1(NH4)2SO4，7g·L-1KH2PO4，2g·L-1Na2HPO4，2g·L-1MgSO4，0.1g·L-1CaCl2，0.07g·L-1FeCl3，PH5.5；(2)利用同源克隆法，根据GenBank上已知序列，以油桐基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，进行TA克隆，并测序，获得目的基因vfFAD2和vfDGAT2；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测；(3)利用耦联小肽，将vfFAD2与vfDGAT2耦联，再与表达载体pCAMBIA1301重组，获得重组载体pCAMBIA1301-vfFAD2-vfDGAT2，酶切、测序验证重组载体；(4)利用农杆菌介导法，将重组载体pCAMBIA1301-vfFAD2-vfDGAT2转化粘红酵母，然后将含有转化粘红酵母的微孔滤膜转移到含60μg·mL-1链霉素，200μg·mL-1头孢霉素和100μg·mL-1卡那霉素的SMⅠ筛选培养基中，培养3-5d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300μg·mL-1头孢霉素，150μg·mL-1卡那霉素的SMⅡ平板上划线，培养3-5d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子；提取基因组DNA、PCR验证获得阳性转化子；(5)气相色谱法检测结果表明，与未转基因粘红酵母相比，转基因粘红酵母转化子油脂含量提高2.76倍，亚油酸含量提高25.86％；其中，扩增引物为：FAD2-F：5’-TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3’；FAD2-R：5’-GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3’DGAT2-F：5’-CTTTCGTTCTGATCGTGCTT-3’DGAT2-R：5’-TAGGCTGTGGATTTTGCTTCG-3’。

申请（专利权）人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所

发明（设计）人:汪阳东;陈益存

法律状态：有效