申请号:201310418736.6

公开（公告）号:103509725B

分类号: C12N 1/19(2006.01);C12N 15/53(2006.01);C12N 15/63(2006.01);

C12P  7/64(2006.01);C12R 1/645(2006.01)

主分类号:C12N 1/19(2006.01)

名称:一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用

公开（公告）日:2016.01.20

申请日:2013.09.16

　　摘要:本发明涉及一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用，其基因工程菌的构建方法主要将35S强启动子和油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2构建表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因在粘红酵母体内获得高效表达。本发明提高粘红酵母油脂中亚油酸的含量。

主权项:1.一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，将35S强启动子和油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2构建表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因在粘红酵母体内获得高效表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下：(1)粘红酵母进行活化和扩培：将粘红酵母保藏斜面转接到PDA培养基上，28℃培养48h之后，挑2环接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，28℃振荡培养24h，然后按1:10的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28℃振荡发酵72h，发酵结束经离心收集菌体；种子培养基：15g·L-1葡萄糖，1g·L-1酵母粉，2g·L-1(NH4)2SO4，7g·L-1KH2PO4，2g·L-1Na2HPO4，1.5g·L-1MgSO4，PH5.5；发酵培养基：50g·L-1葡萄糖，1g·L-1酵母粉，2.5g·L-1(NH4)2SO4，7g·L-1KH2PO4，2g·L-1Na2HPO4，2g·L-1MgSO4，0.1g·L-1CaCl2，0.07g·L-1FeCl3，PH5.5；(2)采用同源序列克隆法，以油桐基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，进行TA克隆并测序，获得目的基因vfFAD2；(3)目的基因vfFAD2与表达载体pBI121重组，获得重组载体pBI121-vfFAD2，酶切、测序验证重组载体；(4)利用农杆菌介导法，重组载体pBI121-vfFAD2转化粘红酵母，然后将含有转化粘红酵母的微孔滤膜转移到含60μg·mL-1链霉素，200μg·mL-1头孢霉素和100μg·mL-1卡那霉素的SMⅠ筛选培养基中，培养3-5d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300μg·mL-1头孢霉素，150μg·mL-1卡那霉素的SMⅡ平板上划线，培养3-5d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子，提取基因组DNA，PCR验证获得阳性转化子；(5)气相色谱法检测，转基因粘红酵母转化子中亚油酸含量和粘红酵母野生型相比，亚油酸相对含量则分别从6.65％提高到13.49％，提高了102.86％；其中扩增引物为：FAD2-F：5’-TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3’；FAD2-R：5’-GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3’；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；3.PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

申请（专利权）人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所

发明（设计）人: 汪阳东;陈益存

法律状态:有效