申请号：201410045774.6

公开（公告）号：103834728B

分类号：C12Q  1/68(2006.01);C12N 15/11(2006.01)

主分类号：C12Q  1/68(2006.01)

名称：扩增植物组织中内生真菌ITS基因的方法及所用引物

公开（公告）日：2016.06.15

申请日：2014.02.08

　　摘要：本发明公开了用于扩增植物组织中内生真菌ITS基因的引物，该引物包括巢式PCR第一轮扩增引物对（正向引物NSA3，反向引物NLC2）和巢式PCR第二轮扩增引物对。本发明还同时提供了利用上述引物进行的扩增植物组织中内生真菌ITS基因的方法，包括植物组织基因组的提取，将提取所得的模板DNA进行PCR扩增，包括巢式PCR第一轮扩增和巢式PCR第二轮扩增。采用该方法可以高质量获得植物组织中真菌的ITS基因片段，为准确解析植物内生真菌生物多样性打下基础。

主权项：1.一种扩增植物组织中内生真菌ITS基因的方法，包括植物组织基因组的提取，其特征是：将提取所得的模板DNA依次进行以下步骤：PCR扩增：包括巢式PCR第一轮扩增和巢式PCR第二轮扩增；1)、所述巢式PCR第一轮扩增的反应体系为：所述正向引物为NSA3，所述反向引物为NLC2；PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸50s，30次循环；最后72℃延伸10min；2)、所述巢式PCR第二轮扩增的反应体系为：所述正向引物为ITS1-F、ITS1-F_KYO2、fITS7、ITS3_KYO2中的任意一个，所述对应的反向引物为ITS2、ITS2_KYO2、ITS4、ITS4；其余同巢式PCR第一轮扩增的反应体系；PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s，30次循环；最后72℃延伸10min；所述巢式PCR第一轮扩增引物对为：正向引物NSA3：5′-AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA-3′，反向引物NLC2：5′-GAGCTGCATTCCCAAACAACTC-3′；所述巢式PCR第二轮扩增引物对为以下任一引物对：①、正向引物ITS1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，反向引物ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′；②、正向引物ITS1-F_KYO2：5′-TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAA-3′，反向引物ITS2_KYO2：5′-TTYRCTRCGTTCTTCATC-3′；③、正向引物fITS7：5′-GTGARTCATCGAATCTTTG-3′，反向引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；④、正向引物ITS3_KYO2：5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′，反向引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

申请（专利权）人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所

发明（设计）人：袁志林;章初龙;陈益存

法律状态：有效